Egorge un poulet, tourne autour du labo en tenant le cadavre encore chaud par les pattes (le sang doit pouvoir goutter par terre), si l'envie de psalmodier un truc inintelligible te prend, laisse toi aller, puis retourne au boulot. Il paraît que ça marche (en tout cas, ça m'a été recommandé lors de mon premier stage dans un labo de recherche, pour régler les problèmes d'interfaçage entre ordinateur et machine de tests mécaniques), de plus le dîner est à moitié prêt...

Mmm j'ai découvert un super truc super pratique que je te fais découvrir avec une immense fierté: le x-gal et le screening blanc/bleu (bon bon OK je sors)
Sinon la purif sur gel + dosage + 15 ng par réaction (Vf 6 µl tout comme ils disent) ça marchait pas mal. Ca me rappelle que je connais une maitre de conf (si si une vraie, avec des bouts de chercheur dedans) à qui on a dit, pour améliorer ses séquençages, de faire la purif sur gel avec du TE (pour éluer s'entend). Ben elle a juste trempouillé son bout de gel dans du TE et a lancé sa réaction de séquence sur ledit TE croupissant. Bon pour du séquençage ça marche pas, mais pour du TOPO qui sait ?
Bisous :)

Uuuuhhhh
Ben je fais tout comme ca [pas le trempouillage, hein, purif sur gel, quantif et 15-20 ng] et le vecteur prend toujours l'insert mini-poucrave, plutot que gros-et-joli. Ca puir.

Bon, que la force soit avec toi, a nous deux, on va ruiner nos labo et faire la fortune d'Invitrocher

Et le systeme Gateway tu peux pas l'utiliser?

Ben le probleme avec gateway, c'est qui faut deja entrer l'insert dans un entry vector, qui est souvent un Topo blunt... bref, si le entry vector veut pas de l'insert, de toute facon, ca aide pas... J'utilise Gateway pour deux genes que je veux exprimer dans baculovirus, ca marche pas mal meme si le rendement a l'etape 1 "insertion dans le Entry vector" est plutot poucrave, bcp de dechet pour peu de clones integrant le bon "gros" insert.
Mais le troisieme gene, pas moyen de le rentrer dans l'entry vector, ni dans le topo TA, que dalle.

Je pensais bien qu'y avait un hic pour ton cas. Mais il me semble me souvenir qu'on pouvait faire ses propres Entry vectors. Ayant moi-meme galere a plusieurs reprises, je suis bien surpris que ce probleme de clonage ne soit pas plus proche d'une solution radicale et definitive. The word is "out-sourcing", ou en francais, je suppose, "laisse faire les autres".

Finalement, tout le monde a l'air d'avoir eu une galere un jour ou l'autre avec ces clonages a la con. Eve en parle recemment, des topo qui marche un jour et pas l'autre en depit de conditions identiques. A la limite c'est surprenant qu'ils vendent encore tout leurs kits si cher... bref, j aurais du temps, je ferais mes constructs moi meme, mais le temps, c'est justement ce qui manque...

Tiens d'ailleurs après une semaine de clonages tip top, vendredi plus rien (même PCR, même protoc, même bactos, etc etc). Heureusement que j'ai accumulé qq boîtes d'avance au frigo (ce qui commence à saouler tout l'étage mébon). Sinon t'as pensé à utiliser des primers + sites enzyme de restriction de chaque côté, digestion du produit de PCR et ligation classique ? J'ai fait 2-3 fois avec succès (mais avec un plus petit fragment)

je le fais des fois, quand j'ai le temps, mais la pas le temps, et de toute facon il faut passer par gateway, protocol oblige. Pas envie de bidouiller de l'entry vector non plus. Donc il faudra bien qu'il le mange son insert, le TOPO!